Adaptación de la RT PCR multiplex en tiempo real, para la detección de SARS-CoV-2 en agrupaciones de muestras.

Abstract

En el año 2020, la OMS declararó el inicio de una contingencia sanitaria de preocupación internacional, debido al Betacoronavirus emergente identificado como el coronavirus causante del síndrome respiratorio agudo severo 22 y responsable de la pandemia originada en la ciudad Wuhan, República Popular China; cuya propagación se daría rápidamente de persona a persona, a través de aerosoles formados por saliva, secreciones respiratorias al toser, estornudar o hablar. Ante esta situación, se desarrollaron diferentes técnicas para el diagnóstico de la enfermedad por SARS-CoV-2 (COVID-19), con el objetivo de identificar, aislar, tratar y dar seguimiento a los pacientes positivos. Tal es el caso de la RT-PCR y sus variantes, que han tenido un papel importante en la identificación de fragmentos del genoma viral, siendo una de las metodologías de diagnóstico más confiables para detectar la enfermedad en sus etapas más tempranas. Pese a esto, la pandemia ha generado el requerimiento de recursos adicionales para el procesamiento de una alta demanda de pruebas, afectando directamente al sector clínico y dando lugar a la escasez de reactivos, insumos, kits de diagnóstico y mano de obra. Una solución a lo anterior, es agrupar muestras biológicas para su análisis en conjunto, ya que, al combinar distintas muestras en la fase de extracción de ácidos nucleicos y conseguir adaptarse a la RT-qPCR, se puede lograr la detección simultánea de un grupo de personas a través del análisis de ARN de diferente origen, en una única reacción. Esta alternativa ha demostrado ser muy eficiente para otros autores, al requerir muy poca inversión y reducir la cantidad de recursos utilizados para analizar un gran número de muestras, en un tiempo menor al del análisis individual. Sin embargo, para poder adaptar esta alternativa a nuestro contexto de trabajo, fue necesario llevar a cabo la evaluación de la sensibilidad y especificidad clínicas, que le dan la capacidad a la RT-qPCR de identificar correctamente individuos sanos y enfermos (respectivamente)16,17 y comprobar que la validez de la prueba no se ve afectada al diluir las muestras en una única mezcla. Esto se consiguió al evaluar 50 diferentes muestras (de las cuales, 5 de estas contenían el virus y 45 se encontraban libres de este), mediante la metodología original y la RT-qPCR para agrupaciones de 3, 5 y 10 integrantes (con un único individuo positivo). Los resultados arrojados por ambas pruebas fueron comparados en un cuadro de 2x215 para el cálculo de los valores de sensibilidad y especificidad, así como valores para la determinación de la seguridad de la prueba. En contraste con el procesamiento de muestras individuales, logramos reducir la cantidad de insumos para las pruebas, así como los desechos generados por el procesamiento de las mismas, el tiempo de procesamiento y el tiempo de uso de algunos equipos (Centrifuga, CFL, CBS) se acorto, además se redujo el volumen de MTV utilizado para las pruebas agrupadas, dejando muestra disponible para otros ensayos. Todo lo anterior, considerando a la RT-qPCR como una prueba dicotómica y bajo la hipótesis de que, si en una agrupación no fue detectado el virus, entonces todos los integrantes de ese grupo son negativos a la prueba. Sin embargo, si existió detección del gen N en la agrupación, al menos uno de los integrantes posee el virus y las muestras deben ser reprocesadas individualmente para encontrar a los verdaderos positivos