Expresión de ligandos de SmicRACK1 en E. coli

Abstract

El estudio de los dinoflagelados fotosintéticos de la familia Symbiodiniaceae ha ganado relevancia debido a que establecen una simbiosis mutualista con cnidarios de importancia ecológica y económica. Actualmente el conocimiento que se ha adquirido sobre los aspectos moleculares que regulan los procesos celulares y metabólicos indispensables para el establecimiento de la simbiosis cnidario-Symbiodiniaceae es escaso. El deterioro actual que enfrentan los arrecifes de coral debido al blanqueamiento coralino, que es un fenómeno en el cual se ve afectada la simbiosis, nos impulsa a determinar los procesos moleculares involucrados en el establecimiento, mantenimiento y ruptura de esta simbiosis mutualista. Una de las principales aproximaciones en elucidar estos procesos moleculares, es la caracterización de las vías de transducción de señales que participan en el ciclo de vida de Symbiodiniaceae, así como de sus hospederos cnidarios. Con este objetivo se estableció el Sistema de Doble Hibrido en levadura (Y2HS) para llevar a cabo el tamizado de una librería de cDNA de Symbiodinium microadriaticum, con la finalidad de identificar ligandos de proteínas de interés. Una estrategia que permite caracterizar vías de señalización es la selección de una proteína que interactúe con más de un ligando de esa vía de señalización para usarla como carnada de estos ligandos. Estas proteínas son llamadas de andamio o anclaje, y estas se encargan de amplificar la señal cuando interactúan con sus ligandos. RACK1 es una proteína de andamio, que tiene una estructura que le confiere una conformación de β-propela, que expone un área de superficie para interactuar con múltiples ligandos simultáneamente. En un trabajo previo se llevó a cabo el tamizaje de la librería de cDNA de S. microadriaticum utilizando como carnada a la proteína SmicRACK1, y se identificaron 7 ligandos positivos por Y2HS. Sin embargo, debido a que esta metodología es muy vulnerable a presentar falsos positivos, se requiere confirmar mediante otras metodologías la interacción de los ligandos con la carnada (en este caso SmicRACK1). El objetivo del presente trabajo fue analizar las secuencias que codifican a los presuntos ligandos de SmicRACK1 para determinar su potencial de ser expresados en E. coli y posteriormente confirmar su interacción. El análisis de las secuencias permitió determinar que 2 de las 7 secuencias analizadas no son factibles para ser expresadas en E. coli. Las otras 5 secuencias fueron identificadas reportadas como, (1) proteína con dominio KDEL/ATP-citrato liasa, ACLY (ATP citrate lyase), SmicKDEL; (2) proteína sensora de calcio neuronal, NCS1 (neuronal calcium sensor protein)/proteína de ritmo circadiano, FRQ (frequency clock protein)/proteína tipo visinina, VSNL1 (visinin-like protein 1), SmicNCS1; (3) proteína de la superfamilia tipo hemeritrina (hemerythrin-like superfamily, Hmrt), SmicHmrt; (4) SIS3 ubiquitina ligasa E3 (E3 ubiquitin ligase protein SIS3), SmicSIS3; y (5) una proteína hipotética no identificada, SmicL18. De estas 5 proteínas se seleccionaron las 4 identificadas para ser expresadas en E. coli, y dos de 2 estas fueron exitosamente expresadas en cantidades suficientes para llevar a cabo el ensayo de inmunoprecipitación con SmicRACK1.