Expresión de proteínas virales en cultivos persistentes del Adenovirus 36 en línea celular

Abstract

Los adenovirus humanos tienden a infectar de manera persistente. La persistencia del ADN adenoviral de ciertos tipos de las especies B, C, D y E se han identificado en el tejido linfoide de las adenoides y del intestino, en epitelios como el pulmonar y de la córnea, así como en el tejido adiposo. La persistencia viral es un fenómeno clave para entender la patogenia de algunas enfermedades crónicas. Desde el punto de vista molecular, es una interacción de ventaja para el virus que se conduce en un equilibrio dinámico y metaestable para permitir la replicación viral y el control de los mecanismos antivirales sin comprometer la supervivencia y multiplicación celular. Actualmente, es de interés el estudio del adenovirus humano tipo 36 (HAdV-36) debido a que su proteína E4orf1 muestra un efecto positivo sobre el metabolismo de la glucosa y los lípidos a pesar de estimular la adipogénesis. Por otro lado, podría tener efectos benéficos en la función hepática y renal. En particular, estudios en ratones han revelado que E4orf1 puede atenuar la lipotoxicidad renal. Estos cambios pueden estar relacionados con la persistencia del virus. Sin embargo, debido a la falta de un modelo, no se ha aclarado de manera suficiente el mecanismo y los factores que explican como los adenovirus pueden inducir una infección persistente. En este trabajo describimos el establecimiento de la infección persistente por HAdV-36 en estado de portador (carrier-state) en células Vero, que se ha mantenido por más de 35 pases o subcultivos en el trascurso de 244 días posinoculación. Los indicadores de la persistencia del HAdV-36 en los pases de cultivo fueron el desarrollo de una infección productiva con la liberación de partículas virales extracelulares en un nivel de 104 y 106 TCID50/mL. La presencia del ADN viral en las células de los pases utilizando la amplificación génica (fragmento del gen E1a) por PCR. La detección cualitativa del antígeno viral mediante ensayos de inmunolocalización por inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa indirectas. Y la confirmación de la inmunodetección del antígeno viral en el 50% de las células de los pases por citometría de flujo. Además, el efecto de la infección sobre la morfología celular se puso de manifiesto utilizando las tinciones de Hematoxilina Eosina, Giemsa y rojo oleoso. Por otro lado, para analizar cómo se expresan E1a y E4orf1, principales genes virales asociados a la remodelación del metabolismo se evaluaron en los pases las expresiones de los mRNAs por RT-qPCR normalizados a la cantidad del ARNm de la α-tubulina y encontramos una baja expresión relativa de E1a y una disminución no significativa en la expresión relativa de E4orf1 después de 53 dpi. Nuestros resultados muestran que las células del epitelio renal (Vero) son permisivas para la infección productiva del HAdV-36 y mantienen al virus de manera persistente por más de ochos meses posinoculación. Finalmente, este trabajo abre la posibilidad de investigar en células Vero genes potencialmente implicados en la persistencia del HAdV-36. Así como, el efecto de la proteína E4orf1 sobre la acumulación de lípidos en células renales.