Desarrollo de una rt-pcr en tiempo real (qrt-pcr) para la detección del virus de la necrosis pancreática infecciosa (ipnv) en trucha arco iris (oncorhynchus mykiss)

Abstract

El virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) es un patógeno de gran importancia para la salmonicultura mundial, y en México fue diagnosticado por primera ocasión en el año 2000; pero actualmente está presente en varios estados del país. Debido a que las vacunas eficaces o medicamentos antivirales no están disponibles para IPNV, la mejora de métodos de diagnóstico diseñados para cepas regionales es el enfoque más adecuado para el control y prevención de la enfermedad. En este sentido, diversas modalidades de la técnica de PCR han resultado un procedimiento prometedor para el diagnóstico, siendo la PCR en tiempo real (qPCR) el proceso considerado de mayor ventaja por su alta sensibilidad, rapidez y confiabilidad. Tomando en cuenta lo anterior, en este trabajo se realizó la estandarización de las técnicas de PCR punto final, multiplex, anidada, PCR en tiempo real (qPCR) y RT-PCR en tiempo real (qRT-PCR) para el asilado mexicano de IPNV, utilizando los iniciadores CIESAIPNV (Barrera et al., 2009), DIAIPN (Taksdal et al., 2001) y DIAint (en este trabajo). La sensibilidad analítica de estos protocolos fue determinada a partir de diluciones de plásmidos recombinantes y diluciones de RNA viral extraído a partir de células CHSE-214 infectadas con IPNV, encontrando que utilizando los iniciadores DIAIPN en una PCR punto final, su sensibilidad analítica fue de hasta 104 plásmidos, no así los iniciadores CIESAIPNV los cuales mediante una PCR punto final registraron sensibilidad menor de hasta 105 plásmidos. La mayor sensibilidad analítica de los iniciadores DIAIPN pudo ser mejorada mediante una PCR anidada, utilizando los iniciadores internos DIAint (en este trabajo) durante la segunda ronda de amplificación obteniendo un rango de detección de hasta 1 plásmido recombinante. Mediante el uso de la técnica qPCR con los iniciadores DIAint se registró un rango de detección de 107 a 103 plásmidos, y mediante una RT-PCR en tiempo real utilizando los iniciadores DIAint y diluciones de RNA obtenido a partir de células CHSE-214 infectadas con IPNV, se obtuvo una sensibilidad analítica de hasta 0.086 pg de RNA. Estos resultados destacan que qPCR fue el método más sensible para detectar el genoma de IPNV ya sea a partir de plásmidos o bien de diluciones de RNA, quedando por determinar su eficiencia a partir de muestras de peces y la ubicación de peces portadores asintomáticos, que permita ofrecer una herramienta fundamental para la toma de decisiones rápidas y oportunas para el control y prevención de IPN.